細(xì)胞嵌入皿是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的一種重要工具，嵌入皿被嵌入培養(yǎng)板內(nèi)，形成上室與下室的結(jié)構(gòu)，兩者分別填充上層與下層培養(yǎng)液，并由一層通透性多孔膜相隔。它通過(guò)膜技術(shù)模擬細(xì)胞的原始生長(zhǎng)環(huán)境，使得體外培養(yǎng)的細(xì)胞在形態(tài)和功能上更接近于體內(nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞。這種技術(shù)特別適用于研究細(xì)胞對(duì)各種刺激（如生長(zhǎng)因子、趨化因子或細(xì)胞外基質(zhì)成分）的響應(yīng)，包括遷移、趨化性和侵襲等現(xiàn)象。

2 遷移or侵襲？傻傻分不清楚

細(xì)胞嵌入皿對(duì)于評(píng)估細(xì)胞通過(guò)多孔膜遷移或侵襲的能力尤為重要，這種多孔膜模擬了細(xì)胞在體內(nèi)必須穿越組織的條件，遷移或侵襲實(shí)驗(yàn)常用孔徑為8μm。

◆遷移實(shí)驗(yàn)（未添加基質(zhì)膠）

在遷移實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞可以從上室直接遷移到下室，無(wú)需降解基質(zhì)膠或侵入膜。這一類型的實(shí)驗(yàn)旨在評(píng)估細(xì)胞對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)劑等的響應(yīng)，展示其遷移能力。

◆侵襲實(shí)驗(yàn)（需添加基質(zhì)膠）

在侵襲實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞必須先將涂覆在膜頂部的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）層降解掉，才能進(jìn)一步遷移到下室中，通過(guò)基質(zhì)膠的設(shè)置，增加了對(duì)細(xì)胞消化及穿透能力的考驗(yàn)，從而更精確地模擬并評(píng)估細(xì)胞在生物體內(nèi)的行為特性。

3 侵襲實(shí)驗(yàn)拆解

操作步驟

DAY 1

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1.觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞去掉培養(yǎng)基，加入無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓處理24h。

2.將基質(zhì)膠置于冰中并在4℃過(guò)夜融化，將24孔細(xì)胞嵌入皿、移液管或槍頭放入4℃預(yù)冷過(guò)夜。

DAY 2

鋪膠 / 鋪板

基質(zhì)膠鋪膠準(zhǔn)備

3.稀釋基質(zhì)膠：在冰上，將基質(zhì)膠用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至1mg/mL，使用預(yù)冷的吸頭混合至均勻狀態(tài)。

4.均勻鋪膠：取60μL上述混合溶液垂直加入嵌入皿中，使其均勻平鋪在底部，注意均勻鋪膠，不要產(chǎn)生氣泡。
5.凝膠：隨后置于37℃孵育2-4h聚合成薄膜，小心吸出未結(jié)合的基質(zhì)膠。

6.基底膜水化：加入100μL無(wú)血清培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱孵育30min，進(jìn)行水化。

細(xì)胞鋪板

7.去除嵌入皿中液體，檢查是否有液體穿過(guò)上室進(jìn)入到下室中，若沒(méi)有，則可用于接種細(xì)胞。

8.用無(wú)血清培養(yǎng)基配制樣本，建議將工作液濃度設(shè)置成終濃度的2倍。隨后按樣本：細(xì)胞懸液=1：1的比例加入到嵌入皿內(nèi)。

9.取500μL含10%FBS的完整培養(yǎng)基加入24孔板下室，用鑷子將嵌入皿置于24孔板內(nèi)。

10.消化饑餓后的細(xì)胞，用1mL無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)上室細(xì)胞接種數(shù)量調(diào)整細(xì)胞密度。

11.先加入50μL的樣本工作液，再加入50μL的細(xì)胞懸液，此時(shí)樣本濃度被稀釋2倍即為終濃度。

12.將24孔板置于37℃，5%CO₂，90%濕度條件下培養(yǎng)24-48h。

DAY 3/4

細(xì)胞固定 / 染色

13.取出嵌入皿，去除培養(yǎng)液，在24孔板干凈的孔中加入600uL 4%多聚甲醛固定液，將小室放入孔中室溫固定15-30分鐘，棄固定液，PBS洗滌小室內(nèi)外2-3次。

14.在24孔板干凈的孔中加入600uL結(jié)晶紫染色液，將小室放入孔中室溫染色8-10分鐘，棄染色液，PBS洗滌小室內(nèi)外2-3次。

15.適當(dāng)風(fēng)干或用棉簽擦干后，在顯微鏡下觀察。

16.用小鑷子小心揭下膜，底面朝上，適當(dāng)風(fēng)干后，移至載玻片上用中性樹(shù)膠封片。在高倍顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野(上、下、中央、左、右各1個(gè))計(jì)數(shù)呈紫色的細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

注：“非貼壁”細(xì)胞計(jì)數(shù)，由于某些細(xì)胞自身的原因或某些膜的關(guān)系，有時(shí)細(xì)胞在穿過(guò)膜后不能附著在膜上，而是掉進(jìn)下室。這種情況下可以收集下層培養(yǎng)液，用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)細(xì)胞量，也可用細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法直接在鏡下計(jì)數(shù)。

結(jié)果示例

利用細(xì)胞嵌入皿檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力時(shí)，需要根據(jù)細(xì)胞特性選擇嵌入皿的孔徑，如下圖，在不同孔徑的PC膜嵌入皿中以相同密度接種HT22細(xì)胞，觀察其遷移情況：

圖：HT22細(xì)胞在不同孔徑嵌入皿的遷移情況

圖：HT22細(xì)胞的尺寸分布

結(jié)論：使用孔徑為8μm的PC膜嵌入皿時(shí)，HT22細(xì)胞表現(xiàn)出較好的遷移能力，且未有明顯的細(xì)胞遺漏、細(xì)胞在孔底貼壁等現(xiàn)象

4 實(shí)驗(yàn)避坑指南

**細(xì)胞死活看仔細(xì)**

接種前檢測(cè)活性＞95%，死細(xì)胞會(huì)干擾背景
**趨化梯度別搞反**

下層培養(yǎng)基血清濃度或趨化因子必須高于上層
**基質(zhì)膠別成“攔路虎”**

基質(zhì)膠過(guò)厚或未全部固化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法穿透

**培養(yǎng)箱濕度要拉滿**

防止小室邊緣液體蒸發(fā)，破壞趨化梯度

**陰性對(duì)照不能少**

下層用無(wú)血清培養(yǎng)基，驗(yàn)證細(xì)胞是否自發(fā)遷移

5 潔特生物細(xì)胞嵌入皿

潔特生物細(xì)胞嵌入皿提供懸掛式和插入式兩種結(jié)構(gòu)類型，且有聚碳酸酯（PC）和聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）兩種膜材、多種孔徑和規(guī)格可選，廣泛用于各類共培養(yǎng)、細(xì)胞分子運(yùn)輸?shù)葘?shí)驗(yàn)中，進(jìn)行運(yùn)輸、吸收和分泌等細(xì)胞功能研究。

* 規(guī)格：培養(yǎng)板（6孔、12孔、24孔）

培養(yǎng)皿（100mm）

* 類型：懸掛式、插入式

* 膜孔徑：0.1μm、0.4μm、1.0μm、3.0μm、5.0μm、8.0μm、12.0μm

* 膜材質(zhì)：膜聚碳酸酯(PC)、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)

* 表面處理：TC處理表面

6 細(xì)胞嵌入皿怎么選

潔特生物提供多種規(guī)格的細(xì)胞嵌入皿，以滿足不同實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景的需求。在選擇細(xì)胞嵌入皿時(shí)，以下幾個(gè)方面是需要考慮的關(guān)鍵因素：

規(guī)格

潔特生物細(xì)胞嵌入皿提供24孔、12孔、6孔培養(yǎng)板以及100mm培養(yǎng)皿等四種容器規(guī)格的產(chǎn)品。選擇時(shí)應(yīng)根據(jù)細(xì)胞數(shù)量、實(shí)驗(yàn)組別設(shè)置和實(shí)驗(yàn)規(guī)模等條件來(lái)決定。

膜材質(zhì)

潔特生物細(xì)胞嵌入皿提供兩種高品質(zhì)膜材選擇，分別為PET膜與PC膜，二者均具備標(biāo)準(zhǔn)化的額定孔密度，可滿足不同實(shí)驗(yàn)需求。

a) 聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜：擁有優(yōu)秀的透光性能，能在顯微鏡下清晰呈現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)與細(xì)胞層的形成過(guò)程，是光鏡觀察、電鏡檢測(cè)以及免疫組化等實(shí)驗(yàn)的優(yōu)選。

b) 聚碳酸酯（PC）膜：細(xì)胞粘附性更強(qiáng)，可有效促進(jìn)跨膜物質(zhì)交換，尤其適用于組別較多、對(duì)細(xì)胞粘附與物質(zhì)交換要求較高的實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景

孔徑

潔特生物細(xì)胞嵌入皿提供0.1μm、0.4μm、1.0μm、3.0μm、5.0μm、8.0μm、12.0 μm等孔徑選擇，可參考下表選擇合適的孔徑。

孔徑	實(shí)驗(yàn)
0.1 μm 0.4 μm 1.0 μm	小分子運(yùn)輸、擴(kuò)散和分泌
0.1 μm 0.4 μm 1.0 μm	通透性實(shí)驗(yàn)、共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、血腦屏障模型、細(xì)胞極性培養(yǎng)
3.0 μm	大分子和病毒的運(yùn)輸、擴(kuò)散和分泌
3.0 μm	血管生產(chǎn)、中性粒細(xì)胞趨化
3.0 μm 5.0 μm	內(nèi)皮細(xì)胞遷移和侵襲
8.0 μm 12.0 μm	腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲